液氮超低温冻结法详细操作步骤

液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

操作步骤如下：

1、安瓿管或冻存管的准备MVE液氮罐

用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

2、保护剂的准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。

3、微生物保藏物的准备

微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。

分装时注意应在无菌条件下操作。

菌种的准备可采用下列几种方法： 刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内;

接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内;

将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块(直径约5-10毫米)，真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内;

在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。

4、预冻

预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。

目前常用的有三种控温方法：

—— 程序控温降温法，应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。

—— 分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。

—— 对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。

5、保藏

将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃，液相中温度为-196℃。

6、复苏方法

从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。MVE液氮罐