用液氮冷冻真空保存犊牛睾丸原质细胞

犊牛睾丸细胞作为多种病毒增殖的基质，已经应用在疫苗生产中，并有广泛的开发前景，但是由于产犊季节的不均衡，给生产带来了困难，为了使生产不受季节影响，同时为了避免由保存原代细胞量大、细胞复活率低的问题，做了用液氮冷冻保存犊牛睾丸原质细胞的试验。MVE液氮罐

　　1 材料与方法

　　1.1犊牛睾丸 出生三天内的，未食初乳的本地黑白花公奶牛。

　　1.2细胞冷冻液的配制

　　冷冻液Ⅰ号：按本实验室设计的方法配制，配方略。

　　冷冻液Ⅱ号：按常规方法配制，即含20%特牛血清，含5%～10%二甲基亚矾的营养液。

　　1.3待冻存细胞的制备

　　1.3.1原质细胞的制备：将犊牛睾丸细胞经一定方法处理后，即在原质细胞自己接加入细胞冻存液中待冻，一般一对牛犊睾丸制备的原质细胞可分装于3～5个安瓶中。

　　1.3.2原代细胞的制备：按常规方法消化犊牛睾丸，制得细胞悬液，放置37℃温室培养，3～4天形成致密单层后，按常规法消化、洗涤、离心，收集细胞泥，分别加入适量的细胞冷冻液，待冻。

　　1.3.3次代细胞的制备：将原代细胞按常规方法消化、培养，得次代细胞单层，再按上述方法收集细胞泥，加入适量细胞冷冻液，待冻。

　　2 细胞的冷冻

　　将上述加入细胞冷冻液Ⅰ号或Ⅱ号液的原质细胞、原代细胞、次原代细胞的细胞瓶，放置4℃、30分钟，再移到-50℃～-70℃冰箱中预冷2小时，然后迅速移到液氮罐中。

　　3 细胞复苏

　　将安瓶自液氮罐中取出，立即放入38-40℃温水中，使细胞在1分钟内融化，无菌吸出细胞悬液，加入新的生长液，将细胞稀释成50万个细胞/ml，37℃培养4小时，细胞贴壁后换液一次，继续增减形成单层细胞。

　　4 结果与讨论

　　实验结果如下：

　　备注：

　　1 每批冻存细胞冻前都有正常细胞培养对照，以确定细胞消化成功与否。

　　2 冻存细胞复活率是指复苏后细胞数/冻前活细胞数比值。

　　3 细胞生长情况批复苏后37℃培养4天时细胞生长的致密情况。

　　4 复苏后的细胞接毒培养后，均能有效带毒，同正常培养细胞无差别。

　　从上表可以看出：

　　1 用冻存方法保存牛睾丸原质细胞，方法是可行的，这给应用牛睾丸细胞增值病毒的生产和试验带来了极大的方便，有利于适当安排生产，同时给器官细胞的保存提供了可靠的依据。

　　2 从上表可见应用本实验室配制的细胞冻存液冻存的细胞，复苏后的存活率要比正常的细胞冻存液要高。

　　3 从上表可以看出，原代、次代细胞经冻存后，复苏的存活率为零，具体原因有待于今后进一步探讨。MVE液氮罐