供体细胞——克隆成功的关键

体细胞核移植技术被广泛应用于生产转基因动物，尤其是基因修饰大动物。供体细胞提供克隆胚胎的主要遗传物质，是体细胞克隆成功与否的关键因素之一。供体细胞的细胞形态、周期、活性以及供体的个体差异、性别年龄等都会对克隆效率有影响。正常机体的自由基氧化作用与抗氧化防御作用处于动态平衡状态。外界环境刺激和机体内氧化反应代谢过程中产生大量活性氧（Reactiveoxygenspe-cies，ROS），对酶及转录因子的活化、mRNA表达等有较大的影响。有研究结果显示SOD及CAT基因的mRNA表达水平出现改变，这可能与细胞抵抗外来刺激有关，但细胞的抗氧化能力是否发生改变，更准确的应该在翻译水平上对SOD及CAT基因的活性进行检测。ROS对细胞膜或者DNA产生伤害，促使凋亡相关基因表达的改变而引发细胞凋亡。Bcl-2蛋白家族与p53基因是重要的细胞凋亡调节因子，两者相互作用，调控细胞凋亡。当Bcl-2和Bax基因形成异源二聚体比例增加时，抑制细胞凋亡。结果显示，G418处理后细胞Bcl-2/Bax基因的比例有所提高，促凋亡基因p53的表达量下调，这可能是细胞自身应对G418所带来的外来刺激而产生的一种自我保护，通过调节自身基因的表达，抑制细胞发生凋亡。MVE液氮罐

在体细胞核移植中，DNA甲基化是调控供体核内重编程的一种方式，对恢复细胞的全能性、提高体细胞核转移的效率具有重要意义。哺乳动物基因组中，转座元件占到了50%左右，LINE是转座元件中所占比例最大的一种类型。LINE-1是LINE中的主要类型，在染色体中散在分布，约占小鼠和人类基因组的17%～20%。微卫星是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分，随机、广泛地分布于基因组中，大约占到猪全基因组的0.85%。因此LINE-1和微卫星的甲基化水平基本可代表整个基因组的甲基化水平。Dnmt1和Dnmt3a分别是维持DNA甲基化和从头甲基化的关键酶。研究表明，敲除小鼠的Dnmt1基因，会导致严重的基因组去甲基化或胚胎死亡;敲除Dnmt3a基因，小鼠在出生后4周内死亡。研究发现，经G418处理后，核供体细胞的Dnmt1和Dnmt3a基因的mRNA表达量均显著下调，表明G418会影响细胞内重要DNA甲基转移酶的mRNA表达，但不影响细胞整体甲基化水平G418处理核供体细胞对猪克隆胚胎体外发育效率的影响。71本研究经高质量浓度G418处理后的供体细胞进行核移植所获得的重构胚的融合率、卵裂率和囊胚率均显著低于对照组，而囊胚细胞总数没有显著差异。这说明供体基因组的整体甲基化水平与克隆胚胎的发育能力可能没有必然联系。这可能是核移植之后G418的毒性作用仍然存在于细胞内，从而影响了细胞生长及克隆胚胎的发育性能。顾晓龙等利用RG108处理供体细胞并进行甲基化水平的检测，发现供体细胞整体甲基化水平的改变可能对提高核移植效率没有直接影响。Bonk等使用低密度甲基化芯片技术检测克隆供体细胞、精子、克隆囊胚、体内囊胚等的甲基化水平，同样发现供体细胞整体甲基化水平的差异并非体外生产的囊胚发育率低下的主要原因，而某些区域特定的DNA甲基化修饰才是促进重构胚胎发育的关键。MVE液氮罐