影响冷冻效果的因素

降温程序是决定冷冻效果的另一个关键因素。若降温速度过快，细胞内部易形成冰晶对细胞造成损伤;若降温速度过慢，会因细胞外部介质的水分结冰而导致细胞过度脱水死亡。因为-60~0℃的低温对细胞的损伤最大，因此要选择合适的降温程序，让细胞在能够适应温度骤变的前提下，迅速安全地通过这个温度危险区，提高冷冻效果。根据研究的数据和相关报道，在精子超低温冷冻前先于4℃平衡15~25min，再于距离液氮面15cm处停留5min，在距离液氮面5cm处停留10min，可使栉江珧、近江牡蛎、马氏珠母贝等精子冷冻效果达到最好。样品体积对冷冻效果也有影响。样品体积的不同可能影响了热的交换，体积小的样品降温快，体积大的样品降温慢，这间接造成了降温条件的差异，导致精子活率不一样。关于双壳类最适冷冻体积的探讨，朱豪磊认为香港牡蛎在冷冻体积为0.75mL时复苏效率最高;李纯认为紫贻贝、栉孔扇贝和菲律宾蛤仔的最适精子冷冻体积分别为0.4、1和1mL。有研究的数据显示，栉江珧和近江牡蛎精子在冷冻体积为1.0~1.4mL的范围内保存效率最高。分析以上研究结果不同的原因，一方面是物种间的差异，更重要的是降温程序存在差异。柯亚夫等认为，不同体积的样品保存时要对应不同的降温方法，以达到最适保存效果。所以，1.0~1.4mL的样品体积最适合栉江珧和近江牡蛎的研究结果，双壳类精子的超低温冷冻保存起始于20世纪70年代。MVE液氮罐

双壳类精子相对于绝大多数脊椎动物而言，体积小、细胞膜薄、细胞内水分少，这些特点非常有利于精子的超低温冷冻保存。研究的数据显示近江牡蛎低温冷冻后精子活率略高于栉江珧，这暗示着近江牡蛎精子较栉江珧精子的抗低温能力较强，可能更适合于精子冷冻保存工作的开展。与此相比，卵子的冷冻保藏技术相对滞后，卵子中存在的大量水分，在冷冻时易形成胞内冰晶而破坏细胞;卵内构成纺锤丝的微管对生化试剂非常敏感;超低温冷冻易造成透明带硬化或破裂，而形成多精受精，这些都是亟待解决的技术难题。精子和卵子超低温保存技术相辅相成，方可有效地推动种质优化和资源保护。MVE液氮罐