研究冻融对绵羊精子ATP酶活性的影响

摘要:为了充分发挥和提高优良种公羊的利用率，提高绵羊冻融精液品质，试验采用酶动力学分光度法对冷冻保存前后小尾寒羊精子和精清中ATP酶活性变化进行研究。说明冻融过程对绵羊精子中ATP酶的活性造成了严重损伤。绵羊冻融精子ATP酶的活性可以在一定程度上预测精子活率，并可作为绵羊精液品质评价的重要指标。MVE液氮罐

1材料与方法

1.1主要试剂

甘油、D-（+）-葡萄糖、蔗糖、青霉素、链霉素，柠檬酸钠、氯化钠、0.2%TritonX-100、Tris-HCl缓冲液（0.1mol/L，pH值8.2）、ATP溶液，分析纯。

1.2主要仪器

高速离心机（型号为ZONKIAHC–2518），紫外可见分光光度计（型号为TU-1810PC/SPC），显微镜（型号为CKX31）。

1.3稀释液的配制

取基础液（葡萄糖3g，蔗糖4g，柠檬酸钠3g，超纯水100mL，煮沸消毒）80mL，加20mL新鲜卵黄液，青霉素、链霉素各10万IU配制成保存稀释液；再取上述溶液94mL加入甘油6mL，配制成冷冻稀释液。

1.4精液采集与常规品质评定

选取膘情中等、体质健康、性欲旺盛的小尾寒羊种公羊，用假阴道法采集精液，立即在37℃下进行常规品质评定，要求原精液密度达到“密”级，活率在0.8以上，无异常气味，色泽乳白，用于试验。

1.5 精液冷冻保存与解冻

1.5.1 精液的稀释与平衡精液常规检查后，将符合要求的新鲜精液根据活率和密度按3～6倍的比例，在35℃下用冷冻稀释液等温稀释，混匀，在室温下用0.25mL的塑料细管进行分装并封口。裹8～10层纱布置于4℃冰箱中平衡2～3h。

1.5.2 精液的冷冻与保存将平衡好的精液细管置于自制冷冻漂浮器上（距离液氮表面2.0～2.5cm，温度在-110～-80℃）熏蒸10min，投入液氮保存。

1.5.3 精液的解冻从液氮罐中取出精液细管，迅速浸入39～40℃水浴中，轻轻摇动直至融化（10～15s）。

1.6 精子活率的评定将稀释精液摇匀后，取中层精液10μL滴于经37℃恒温板等温预热的载玻片上，盖片后置于显微镜下放大400倍检查精子1000个以上，分别计算呈直线运动精子数和总精子数，计算精子活率。

1.7 ATP酶活性的测定

1.7.1 ATP酶的提取精液总ATP酶粗提液:取120μL稀释精液于离心管中，加入360μL0.2%TritonX-100，抽提20min，然后4000r/min离心30min，保留上清液待测。精清中ATP酶粗提液:取120μL稀释精液于离心管中，加入自制稀释液360μL2000r/min离心20min，保留上清液待测。精子中ATP酶粗提液:将上一步所得沉淀加入0.2%TritonX-100360μL抽提20min，4000r/min离心30min，保留上清液待测。

1.7.2 ATP酶活性的测定取纯化水2.21mL，ATP溶液1.10mL，混匀后加入25℃预热的ATP酶待测液0.19mL（空白管用纯化水代替），迅速摇匀倒入比色皿（光径为1cm），700nm处每隔1min测定1次OD值，每次测5min。

1.7.3 ATP酶活性的计算公式为:酶活力=（测定管OD值-对照管OD值）×1/（60×取样量）×样品稀释倍数。

1.8 数据的统计与分析采用SPSS10.0统计软件对试验数据进行统计分析，差异显著性采用Excel软件中数据分析工具库进行描述统计、t检验和方差分析。试验重复5次以上。

2.结果与分析

结果见表1。由表1可见，与冷冻前相比，冷冻后小尾寒羊精子中ATP酶活性极显著降低（P＜0.01），精清中ATP酶活性极显著升高（P＜0.01），说明冷冻保存对绵羊精子中ATP酶的活性造成了严重损伤。冷冻前后精子活率与精子ATP酶活性均呈极显著正相关（r=0.979和0.968，P＜0.01），说明精子ATP酶活性能够反映精子活率，可作为精液品质评价的指标。MVE液氮罐